BioArt按：糖基化是最復(fù)雜的蛋白后修飾之一，具有多種重要的生物學(xué)功能。與其他蛋白后修飾相比，糖基化更為復(fù)雜，分析難度很大。目前已有的糖基化分析方法有明顯的局限性：大部分方法僅能分析糖鏈或糖基化位點(diǎn)等不完整的糖基化信息，而基于糖肽的位點(diǎn)特異性分析方法則存在通量低，假陽(yáng)性率高，數(shù)據(jù)質(zhì)量難以評(píng)測(cè)等問(wèn)題。9月5日，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊芃原課題組與中科院北京計(jì)算技術(shù)研究所賀思敏課題組以及上海蛋白質(zhì)中心黃超蘭課題組合作，在Nature Communications雜志上在線發(fā)表了題為“pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification”的研究論文，該研究展示了高通量、高質(zhì)量的完整N糖肽分析流程。該研究為精準(zhǔn)糖蛋白質(zhì)組分析提供了新的分析工具，并提供新的糖肽譜圖質(zhì)量評(píng)估方法以及目前最大的糖肽數(shù)據(jù)集。
論文解讀：
隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜的發(fā)展，后修飾蛋白質(zhì)組的研究大量涌現(xiàn)。其中磷酸化、乙?；群笮揎椀姆治黾夹g(shù)已經(jīng)十分成熟。而作為最復(fù)雜的蛋白后修飾之一，糖基化分析的技術(shù)挑戰(zhàn)也是最大的【1，2】。與其他蛋白后修飾相比，糖基化不但會(huì)產(chǎn)生宏觀不均一性（每個(gè)蛋白上可能有多個(gè)后修飾位點(diǎn)），更會(huì)產(chǎn)生海量的微觀不均一性（每個(gè)位點(diǎn)上可能有幾十甚至上百種不同的后修飾基團(tuán)）。除此之外，糖鏈本身的離子化效率很低。這些因素的結(jié)合使得糖基化分析的通量和質(zhì)量遠(yuǎn)低于蛋白質(zhì)組學(xué)的常規(guī)分析水平【2，3】。
目前成熟的糖基化分析方法因技術(shù)的限制，通常只能分析不完整的后修飾信息，例如糖基化位點(diǎn)或者從蛋白上釋放的糖鏈。在此類分析中，重要的蛋白-糖鏈連接信息被丟失【1-3】。完整的糖基化信息需要直接分析完整糖蛋白或完整糖肽（intact glycopeptide）。
已有的完整糖肽分析技術(shù)存在以下問(wèn)題：
1）通量較低。由于解析完整糖肽需要獲得肽段與糖鏈的信息，人們通常使用多種質(zhì)譜碎裂技術(shù)或者多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的組合，從而限制了整體通量【3-5】；
2）精度低，假陽(yáng)性率很高。常規(guī)蛋白質(zhì)鑒定的假陽(yáng)性率在1%以下，而完整糖肽鑒定數(shù)據(jù)中的假陽(yáng)性率甚至?xí)哌_(dá)20%【6】；
3）缺乏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)糖肽的合成非常困難，完整糖肽分析無(wú)法采用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)控評(píng)測(cè)，從而使得該領(lǐng)域的發(fā)展緩慢，數(shù)據(jù)質(zhì)量層次不齊。
該研究開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)，解決了上述完整糖肽分析的三個(gè)問(wèn)題。首先，研究人員廣泛測(cè)試了目前最新質(zhì)譜儀器支持的各種碎裂方式并進(jìn)行了系統(tǒng)性分析、模擬，最后挑選了經(jīng)過(guò)優(yōu)化的階梯能量HCD（higher-energy collisional dissociation）作為糖肽的質(zhì)譜圖采集方法。這種方法能夠獲得豐富的完整糖肽碎片信息，同時(shí)保證了數(shù)據(jù)采集效率。隨后，研究人員開(kāi)發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的完整糖肽檢索引擎pGlyco2.0。
pGlyco2.0能夠充分利用階梯能量HCD糖肽譜圖種的碎片信息，并且在糖鏈、肽段和糖肽三個(gè)層面都進(jìn)行質(zhì)控，從而獲得高質(zhì)量的鑒定結(jié)果（下圖）。作為對(duì)比，目前絕大多數(shù)完整糖肽檢索引擎只對(duì)糖鏈或者肽段進(jìn)行單方面的質(zhì)控。
在此基礎(chǔ)上，研究人員開(kāi)發(fā)了基于重標(biāo)技術(shù)的糖肽數(shù)據(jù)質(zhì)控流程（下圖），首次在復(fù)雜樣品（酵母）中，客觀地比較了不同檢索引擎匯報(bào)糖肽結(jié)果的假陽(yáng)性率：pGlyco2.0的假陽(yáng)性率不到1%，而目前最常用的商用軟件Byonic，其假陽(yáng)性率在特定情況下高達(dá)20%。該質(zhì)控流程為完整糖肽分析領(lǐng)域提供了全新的工具和標(biāo)準(zhǔn)，可以作為后續(xù)方法發(fā)展的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。
糖肽數(shù)據(jù)質(zhì)控流程示意圖
最后，研究人員使用pGlyco2.0整套流程，在小鼠五個(gè)臟器（心肝腦肺腎）中，鑒定了超過(guò)一萬(wàn)條非冗余糖肽，是目前最大的完整糖肽數(shù)據(jù)集。
值得一提的是，該工作是2016年發(fā)表在Scientific Reports雜志上的相關(guān)研究的一個(gè)較大的延伸（下圖）。2016年該研究團(tuán)隊(duì)就首次報(bào)道了一款解析完整 N-糖肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)的軟件——pGlyco。該軟件利用了質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)的HCD （High Collsion dissociation）和CID（Collision-induced dissociation ）碎片信息實(shí)現(xiàn)了糖肽的鑒定解析，填補(bǔ)了目前完整N-糖肽鑒定方法中缺少false discovery rate (FDR)分析、糖肽鑒定方法中缺少充足碎片信息的空缺，挑戰(zhàn)了糖蛋白組學(xué)分析中最困難的方面，解決了目前N-糖肽鑒定中FDR高等問(wèn)題，達(dá)到對(duì)蛋白糖基化微異質(zhì)性的可靠表征。
據(jù)悉，該論文的共同第一作者有五位，分別為復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院博后劉銘琪，北京中科院計(jì)算所助理研究員曾文鋒，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院博士方盼，博后曹緯倩，中科院北京計(jì)算技術(shù)研究所助理研究員劉超。復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊芃原教授，中科院北京計(jì)算技術(shù)研究所賀思敏研究員，上海蛋白質(zhì)中心黃超蘭研究員為共同通訊作者。復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院為第一完成單位。該項(xiàng)目得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，國(guó)家重大儀器專項(xiàng)，973和863計(jì)劃的支持。
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楊芃原教授簡(jiǎn)介
楊芃原教授，現(xiàn)任復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系特聘教授，生物醫(yī)學(xué)研究院常務(wù)副院長(zhǎng)。曾任中國(guó)人類蛋白質(zhì)組學(xué)學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)，質(zhì)譜學(xué)會(huì)常務(wù)理事，國(guó)家蛋白質(zhì)重大科學(xué)研究計(jì)劃專家組成員，兩次擔(dān)任國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（973計(jì)劃）首席科學(xué)家，除此之外還主持了多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金委重大重點(diǎn)項(xiàng)目與上海市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。曾獲教育部自然科學(xué)一等獎(jiǎng)、二等獎(jiǎng)、福建省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)，教育部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)等多個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)。以通訊作者發(fā)表SCI論文兩百余篇。主要研究方向?yàn)樯镔|(zhì)譜儀器開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。
賀思敏研究員簡(jiǎn)介
賀思敏，現(xiàn)任中科院北京計(jì)算技術(shù)研究所研究員。1986年－1991年本科畢業(yè)于清華大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)專業(yè)；1991年－1997年繼續(xù)在清華大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)專業(yè)獲得博士學(xué)位；1997年－2002年，國(guó)家智能計(jì)算機(jī)研究中心-摩托羅拉聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京算通科技發(fā)展有限公司；2002年7月－ 中國(guó)科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所。主要研究方向?yàn)椋簯?yīng)用算法學(xué)、生物信息學(xué)、信息檢索。與生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的主要成果是主持研制我國(guó)第一套規(guī)?；鞍踪|(zhì)序列鑒定軟件系統(tǒng)pFind。近年來(lái)的研究工作主要發(fā)表在Nature Method、Nature Communications、Bioinformatics、Journal of Proteome Research、 Scientific Reports等雜志上。
黃超蘭研究員簡(jiǎn)介
黃超蘭，現(xiàn)任中科院上海生化與細(xì)胞研究所上海（國(guó)家）蛋白質(zhì)中心研究員。1994年香港中文大學(xué)取得學(xué)士學(xué)位后，于1996年進(jìn)入香港大學(xué)研究院（化學(xué)系）獲理學(xué)碩士（1998）和博士學(xué)位（2002）。博士論文專門研究基本原理質(zhì)譜 (Fundamental mass spectrometry) 中的氨基酸和多肽的氣相裂解機(jī)理 (gas phase fragmentation mechanism of amino acid and peptide) 。2003-2005 在香港大學(xué)化學(xué)系支志明教授組從事研究助理，協(xié)助港大生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)中心（BDC，HKU）和香港特區(qū)衛(wèi)生部（Department of Health, HKSAR）建立新的標(biāo)準(zhǔn)化分析實(shí)驗(yàn)室，制定政府中藥藥典。于2005 年4月以訪問(wèn)科學(xué)家身份到John Yates 教授 （The Scripps Research Institute, TSRI）實(shí)驗(yàn)室，2006 年成為John的博士后研究員，2008 年被聘為Staff Scientist, 2010 年晉升為Senior Staff Scientist，并同時(shí)為國(guó)家中心研究資源(NIH)的酵母資源中心（Yeast Resource Center, YRC）和Scripps生理蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心（Center for Physiological Proteomics, CPP）的Lead Scientist。2013年1月起，任中科院上海生科院生化與細(xì)胞所研究員、國(guó)家蛋白科學(xué)中心質(zhì)譜系統(tǒng)主管。2014年入選中科院引進(jìn)杰出技術(shù)人才。
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